酶标仪是一台变相的光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计几乎相同。
光源灯发出的光线经过滤光片或单色器后，成为一束单色光束。该单色光束经过塑料微孔板中的待测标本，被标本吸收掉一部分后，到达光电检测器。光电检测器将投射到其上面的光信号的强弱变成电信号的大小。此电信号经前置放大、对数放大、模数转换等模拟信号处理后，送入微处理器进行数据处理和计算。最后由显示器和打印机将测试结果显示、打印出来。
微处理机还通过控制电路来控制X、Y方向的机械驱动机构的运动。但对于非自动型的酶标仪，它是用手工来移动微孔板的，可以省去X、Y方向的机械驱动机构及其电路，这样的仪器体积更小，结构也更简单。
微孔板是一种用来盛装待测样本的透明塑料板，板上有多排小孔，如有40孔板、55孔板和96孔板等多种规格。每个小孔可以盛放零点几毫升的溶液。根据仪器的不同，既可以一个孔一个孔地检测，也可以一排孔一排孔地检测。
酶标仪既可以使用和分光光度计相同的单色器，也可以使用干涉滤光片来获得单色光。和光电比色计一样，使用滤光片作过滤装置时，将滤光片设计到微孔板的前面和后面效果是一样的。
一般酶标仪的光束既可以设计成从上到下通过比色液，也可以设计成从下到上通过比色。它和普通光电比色计的不同之处在于：一是盛装比色液的容器不是使用比色皿，而是使用了塑料微孔板，塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作，之所以采用塑料微孔板来作固相载体，是利用它对抗原或抗体有较强的吸附这一特点；二是酶标仪的光束是垂直通过待测液的；三是酶标仪通常不使用A而是使用光密度OD来表示吸光度。
酶标仪有单通道和多通道两种类型，单通道又分为自动型和手动型两种。其中，自动型的仪器设有X和Y两个方向的驱动机构，在机械装置的驱动下，微孔板上的小孔一个个依次进入光束下面测试。手动型靠手移动微孔板来进行测量。
在单通道酶标仪的基础上，又发展了多通道、全自动型酶标仪。多通道酶标仪一般都是自动型的，它设有多个光束和多个光电检测器。如8通道的仪器，设有8条光束（或8个光源）、8个检测器和8个放大器。在机械驱动装置的作用下，样品被8个一排、8个一排检测。多通道酶标仪的检测速度快，但其结构比较复杂，价格也较贵，多用于大中型医院。
酶标仪的其他部分的结构，与光电比色计和小型生化分析仪基本相同。